2. مواد و روشها
## 2.1. مواد
تمام معرفها درجه تحلیلی بودند و مگر در موارد ذکر شده به همان صورت استفاده شدند. N-هیدروکسی فتالیمید (NHPI، ≥98%)، اسید استیک یخچالی، سدیم استات، اسید کلریدریک (37%)، سدیم هیدروکسید و بوتیلهیدروکسی تولوئن (BHT، ≥99%) از شرکت Merck (آلمان) یا Sigma-Aldrich (ایالات متحده) تهیه شدند. از اتانول و آب دیونیزه به عنوان حلال در موارد ذکر شده استفاده شد. واکنشهای الکتروشیمیایی در یک سلول تقسیمنشده با الکترودهای تیتانیومی (درجه 2، 99.5%، 2 × 2 سانتیمتر) به عنوان آند و کاتد انجام شد. قبل از استفاده، الکترودها صیقل داده شدند، به صورت فراصوتی در اتانول و آب (هر کدام 10 دقیقه) تمیز شدند و در هوا خشک شدند.
برای نیمهصنعتی (1.0 کیلوگرم کیتوسان)، از اسید استیک درجه مواد غذایی/دارویی (شرکت دکتر مجلی، ایران، ≥98%) برای کاهش هزینهها و در عین حال اطمینان از سازگاری استفاده شد. راکتور از الکترودهای تیتانیومی بزرگتر (40 × 28 سانتیمتر، همان درجه و پیشتصفیه) استفاده کرد و بافر استات با استفاده از همان ترکیب، اسید استیک 0.2 مولار و سدیم استات 0.3 مولار (5/0 ± 4.5 = pH) تهیه شد. مگر در موارد مشخص شده، همه مواد در شرایط محیطی نگهداری و استفاده شدند.
**2.2. ابزار دقیق**
آزمایشهای الکتروشیمیایی با استفاده از یک پتانسیواستات/گالوانواستات (Autolab PGSTAT302N، Metrohm) مجهز به FRA32M برای تحلیل امپدانس انجام شد. آزمایشهای الکتروشیمیایی در یک سلول تقسیمنشده با صفحات تیتانیوم درجه 2 به عنوان آند و کاتد انجام شد. برای تحلیل مکانیکی و شکل موج، یک الکترود مرجع Ag/AgCl اشباع صرفاً برای نظارت بر پتانسیل فصل مشترک گنجانده شد، در حالی که کنترل جریان همیشه در پیکربندی دو الکترودی اعمال شد. تمام اجراها در یک سلول تقسیمنشده دو الکترودی تحت عملیات جریان ثابت یا تحت پروفایل پالس GONOGO (بخش 2.4)، با نظارت بیدرنگ و برنامهریزی پالس از طریق NOVA 2.1 انجام شدند. برای مقیاسسازی، از یک کنترلکننده گالوانواستاتیک سفارشی (0-120 آمپر، 0-60 ولت) با منطق روشن/خاموش قابل برنامهریزی برای بازتولید پروفایل پالس Go/No-Go بهینهشده تأیید شده در آزمایشهای آزمایشگاهی استفاده شد. pH محلول با استفاده از یکpH متر رومیزی کالیبره شده (827 pH Lab، Metrohm) اندازهگیری شد، در حالی که دما در 2 ± 25 درجه سانتیگراد حفظ شد، مگر اینکه غیر از این مشخص شده باشد. characterization تحلیلی شامل HPLC (Shimadzu LC-20AD، RP-C18، تشخیص UV-Vis)، FTIR (Bruker Tensor II، ATR، 400-4000 cm^-1^)، NMR (^1^H، ^13^C، COSY، HSQC، Bruker AVANCE III 400 MHz، D~2~O)، تعیین رطوبت (تیتراسیون کارل فیشر، Mettler Toledo V20)، تعیین مقدار فلزات جزئی (ICP-OES، Agilent 5110)، طیفسنجی جرمی (GC-MS، Agilent 7890A/5975C، EI)، آنالیز عنصری (CHNS، Thermo Flash 2000)، و TLC (سیلیکاژل 60 F254، UV 254 nm) در صورت لزوم بود. مگر اینکه غیر از این ذکر شده باشد، آزمایشهای کلیدی الکترولیز و اندازهگیریهای تحلیلی به صورت سهتایی انجام شدند و نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار گزارش شدهاند.
## **2.3. منبع کیتوسان**
کیتوسان تا حدی استیلزداییشده (DD = 86.4%) از پوسته میگو از طریق آبزدایی متوالی، پروتئینزدایی و استیلزدایی قلیایی تهیه شد. روششناسی کامل استخراج، characterization تحلیلی (FTIR، NMR، CHNS) و تعیین DD در کار قبلی ما به تفصیل ارائه شده است [4].
**2.4. شکست الکتروشیمیایی در شرایط GONOGO**
شکست الکتروشیمیایی در یک سلول دو الکترودی تقسیمنشده تحت کنترل گالوانواستاتیک انجام شد. الکترودهای تیتانیومی (2 سانتیمتر × 2 سانتیمتر)، که به عنوان پیکربندی بهینه انتخاب شدند (بخش S11 برای غربالگری الکترود را ببینید)، به عنوان هر دو الکترود کار و شمارنده عمل کردند. قبل از هر آزمایش، الکترودها به صورت مکانیکی صیقل داده شدند و با آب دیونیزه شسته شدند تا اکسیدهای سطحی حذف شده و تکرارپذیری تضمین شود.
الکترولیت شامل 100 میلیلیتر بافر استات تهیه شده از اسید استیک یخچالی 0.2 مولار و سدیم استات 0.3 مولار (5/0 ± 4.5 = pH) بود. کیتوسان (300 میلیگرم)، که از قبل در اسید استیک آبی 2% (حجمی/حجمی) حل شده بود، به محیط الکترولیز معرفی شد و سپس 10% مولی NHPI به عنوان یک مدیاتور ردوکس اضافه شد.
پروتکل GONOGO به عنوان یک رژیم روشن/خاموش نامتقارن پیادهسازی شد که در آن هر فاز Go با یک فاصله No-Go با مدار باز واقعی دنبال میشد. در شرایط واسطه NHPI و Ti استفاده شده در این مطالعه، سیستم یک الگوی آرامش پایدار نشان داد که به طور مداوم به زمانبندی مؤثر 2 ثانیه Go و 6 ثانیه No-Go همگرا میشد. بنابراین کنترلکننده پالس به گونهای تنظیم شد که با این رفتار آرامش تعیین شده تجربی مطابقت داشته باشد، نه اینکه زمانبندی خارجی دلخواه را تحمیل کند.
برای مقیاسسازی نیمهصنعتی (1.0 کیلوگرم کیتوسان)، از همان پروفایل GONOGO (2 ثانیه / 6 ثانیه) با استفاده از یک کنترلکننده توان گالوانواستاتیک قابل برنامهریزی و الکترودهای تیتانیومی (40 سانتیمتر × 28 سانتیمتر) استفاده شد. حجم کل واکنش 15 لیتر بود که با استفاده از همان سیستم بافر استات (اسید استیک یخچالی 0.2 مولار و سدیم استات 0.3 مولار، 5/0 ± 4.5 = pH)، با مقیاسبندی متناسب بارگذاری NHPI و غلظت بستر تهیه شد. الکترولیز به مدت 8.5 ساعت تحت هم زدن مداوم انجام شد، در حالی که تمام پارامترهای دیگر ثابت نگه داشته شدند.
پس از اتمام، مخلوط واکنش برای حذف جامدات واکنش نداده فیلتر شد. مایع حاصل مستقیماً تحت فرآیند پاییندستی همانطور که در بخش 2.5 توضیح داده شده قرار گرفت.
**2.5. جداسازی و characterization محصولات**
پس از اتمام الکترولیز، مخلوط واکنش به تدریج با استفاده از بی کربنات سدیم جامد تحت هم زدن مداوم تا 7 ≈ pH خنثی شد. سوسپانسیون برای حذف هرگونه باقیمانده نامحلول فیلتر شد. سپس مایع شفاف با اسید کلریدریک غلیظ تا 4 pH اسیدی شد و به دنبال آن 200 میلیلیتر اتانول مطلق به آرامی تحت هم زدن اضافه شد. مخلوط به مدت 3 ساعت در دمای اتاق بدون مزاحمت رها شد تا GlcN·HCl و GlcNAc به طور همزمان رسوب کنند. جامد حاصل با فیلتراسیون خلأ جمعآوری و در 55 درجه سانتیگراد خشک شد.
جامد خام خشک شده، حاوی مخلوطی از GlcN·HCl و GlcNAc، در حداقل حجم آب/متانول (7:3، حجمی/حجمی) حل شد و برای جداسازی تحت کروماتوگرافی ستونی سیلیکاژل قرار گرفت. کروماتوگرافی با استفاده از یک ستون شیشه ای (طول 60 سانتیمتر × قطر داخلی 3.5 سانتیمتر) پر شده با سیلیکاژل 60 (70-230 مش) انجام شد. شستشو با گرادیان پلهای آب/متانول (از 9:1 تا 7:3، حجمی/حجمی) انجام شد. کسرها با استفاده از TLC با سیستم آب/متانول (8:2، حجمی/حجمی) و مشاهده با نین هیدرین پایش شدند. کسرهای حاوی GlcNAc و GlcN·HCl خالص به طور جداگانه جمعآوری، در فشار کاهش یافته تغلیظ و به عنوان محصولات خالص جمعآوری شدند.
برای نیمهصنعتی (1.0 کیلوگرم کیتوسان خشک در 15 لیتر بافر استات)، همان روش جداسازی و خالص سازی با استفاده از 30 لیتر اتانول مطلق برای مرحله رسوب اولیه به کار گرفته شد. بازده وزنی نهایی و خلوص GlcNAc و GlcN·HCl با استفاده از تیتراسیون کارل فیشر و روش HPLC مبتنی بر USP که در بخش S7 و S6 توضیح داده شده است تعیین شدند، بازدههای خشک تصحیح شده 127.20 گرم (12.72٪، خلوص 99.1%) برای GlcNAc و 708.35 گرم (70.84٪، خلوص 99.2%) برای GlcN·HCl بود، بدون اینکه محصولات جانبی شناسایی شوند و با تکرارپذیری عالی (RSD < 1.5%).
هویت و خلوص GlcN·HCl و GlcNAc با characterization طیفسنجی و تحلیلی جامع، از جمله NMR ^1^H و ^13^C، FTIR، MS، و آنالیز عنصری CHNS تأیید شد که همگی با مقادیر مورد انتظار مطابقت داشتند. دادههای طیفی کامل در اطلاعات تکمیلی (بخش S2) ارائه شده است.